• slidebg1
  • slidebg1

Специалистам

Исследования

Биологически активный комплекс БИОКУРАТОР® — новое средство от преждевременного старения кожи.

Введение

Гистидин-содержащий пептид — карнозин (β-Ala-His) — рассматривается в качестве весьма перспективного компонента для косметики «против старения» (3). Он отлично связывает и нейтрализует соединения, избыток которых в клетке может оказывать токсическое действие: ионов водорода, тяжелых металлов (свинца, ртути, кадмия), активных форм кислорода, свободных радикалов, токсичных продуктов перекисного окисления липидов (3, 4). Считается, что антиоксидантные свойства карнозина во многом обеспечивают его противовоспалительную, антистрессорную, радиопротекторную, противоишемическую, ранозаживляющую активность, а также способность задерживать процессы биологического старения (1).

Сходными с карнозином свойствами обладает дипептид анзерин (β-Ala-N1-metHis). Лабораторией Биотехнологий НПО «Техкон» был получен натуральный биологически активный комплекс Биокуратор содержащий гистидин содержащие дипептиды (карнозин и анзерин). Лабораторией биофизики НПО ТЕХКОН совместно с кафедрой биотехнологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и кафедрой фармакологии медико-биологического факультета РГМУ были проведены его первые медико-биологические испытания с целью выявления полезных для косметики свойств.

Химический состав Биокуратора

Рядом исследований показано потенцирование биологических эффектов карнозина и анзерина такими веществами как Са2+, флаваноиды и др.

Таблица 1. Состав Биокуратора  
Сухие вещества мг/мл: 69¸71
Карнозин 0,5¸0,8
Анзерин 1,1¸1,9
Аминокислоты и низкомолекулярные пептиды 36,8¸47,7

Наличие в составе Биокуратора свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, способных проникать не только вглубь кожи (по гидрофильным межклеточным каналам эпидермиса), но и внутрь самих клеток с помощью переносчиков, делает его полезным для косметических целей с точки зрения дополнительного питания кожи. Содержащиеся в Биокураторе карнозин и анзерин придают ему антиоксидантные и иные полезные свойства, которые присущи этим природным биорегуляторам. Известно, что карнозин может проникать в кожу (2), возможно, по гидрофильным межклеточным каналам в эпидермисе. Он может оказывать регулирующее влияние на клетки, например, связываясь с их поверхностными рецепторами (6). По некоторым сведениям (5), карнозин может проникать и внутрь клеток с помощью специальных переносчиков.

Исследование токсичности Биокуратора

Цитотоксический эффект. Исследование цитотоксичности проводилось в монослойных культурах фибробластов кожи. Первичную культуру клеток после суспензирования рассеивали по 100 мкл в 96-луночные планшеты. Образцы Биокуратора в объеме 10 мкл вносили в лунки до конечной концентрации 1, 0,5 и 0,1%. По окончании соответствующего срока инкубации воздействие препарата на клеточный рост определяли МТТ – тестом. Метод основан на редукции тетразолевого кольца 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-dyphenyl tetra/olium bromide (MTT) дегидрогеназами митохондрий пролиферирующих клеток с образованием кристаллов формазана и является стандартным для оценки токсичности соединений в культуре. Для подсчета количества клеток культуры в отдельных лунках после инкубации окрашивали метиленовым синим и фотографировали с помощью системы МЕКОС. Табл 2. Метаболическая активность клеток в присутствии образцов Биокуратора и контроля (консерванта). Представлены значения оптической плотности образцов.

Сутки Образец Концентрация образца в пробе, %
1 0,5 0,1
1 Биокуратор 0,302±0,037 0,338±0,035 0,317±0,019
Контроль 0,346±0,027 0,347±0,039 0,332±0,040
Чистый контроль   0,365±0,041  
2 Биокуратор 0,196±0,054 0,261±0,028 0,293±0,097
Контроль 0,178±0,037 0,270±0,054 0,267±0,047
Чистый контроль   0,314±0,025  
3 Биокуратор 0,380±0,027 0,460±0,019 0,324±0,171
Контроль 0,452±0,115 0,654±0,124 0,346±0,102
Чистый контроль   0,426±0,032  


Рис 1. Влияние препарата Биокуратор на выживаемость культуры клеток фибробластов.

Результаты, представленные в табл.2, свидетельствуют о том, что Биокуратор, добавленный в среду инкубации в концентрациях 0,1%, 0,5% и 1,0%, практически не изменяет метаболическую активность фибробластов на протяжении 3-х суток наблюдения. Количество же клеток, сохраняющих свою жизнеспособность, под влиянием 0,1% и 0,5% Биокуратора, увеличивается по сравнению с контролем (рис.1).

Таким образом, при концентрации 0,1 – 0,5% Биокуратор не только не оказывает токсического действия на клетки кожи, но и способствует их выживанию в культуре ткани. Антиоксидантная активность Биокуратора. Тот факт, что за 70 лет жизни человека организм производит около одной тонны радикалов кислорода,говорит о большой потребности организма человека, а в частности кожи, в антиоксидантах. Все антиоксиданты, синтезируемые организмом или поступающие в него с пищей, препятствуют развитию «окислительного стресса» и его негативных последствий. При окислительном стрессе в ткани накапливается избыточное количество очень активных и агрессивных веществ: свободных радикалов, оксида азота (NO), «вторичных сигнальных молекул» и многих других. Свободные радикалы инициируют лавинообразно нарастающие реакции перекисного окисления липидов, входящих в состав клеточных мембран. В результате этих процессов клеточные мембраны претерпевают структурно-функциональные изменения, приводящие к нарушению их барьерно-транспортной функции. Радикалы и продукты перекисного окисления угнетают реакции клеточного иммунитета, образуют поперечные сшивки между макромолекулами ДНК и коллагена, способствуют возникновению генетических мутаций, повышая риск заболевания раком кожи, вызывают нарушения микроциркуляции крови. Применение антиоксидантов в косметике позволяет приостановить преждевременное старение кожи, связанное с неблагоприятным экологическим климатом или недостаточным содержанием антиоксидантов в пище. Известно, что синтетический карнозин является антиоксидантом. Мы провели сравнительные исследования антиоксидантной активности синтетического карнозина и Биокуратора. Для этих целей мы использовали метод хемилюминесценции на модели Fe2+-индуцированного перекисного окисления липидов сыворотки крови человека, а так же метод измерения скорости восстановления стабильного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ).

1. Влияние Биокуратора на скорость восстановления стабильного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ).

ДФПГ имеет свойство восстанавливаться и изменять свою окраску в среде, в которой присутствуют антиоксиданты. Скорость его восстановления тем выше, чем выше антиоксидантная активность исследуемого раствора. Как следует из данных, приведенных в таблице 3, отдельно взятый карнозин в концентрации 0,4 мМ проявляет антиоксидантные свойства, восстанавливая ДФПГ со скоростью 0,26 нМ/мин. При вдвое большей концентрации карнозина (0,8 мМ) скорость восстановления ДФПГ возрастает до 0,39 нМ/мин. Пробы Биокуратора, содержащие всего 0,2 мМ карнозина вместе с анзерином, восстанавливают ДФПГ со скоростью в 5-10 раз большей (1,71-3,19нМ/мин). Таким образом, антиоксидантная активность Биокуратора в 5-10 раз превышает антиоксидантную активность карнозина или анзерина, взятых в отдельности. Несомненно, что в составе Биокуратора, помимо карнозина и анзерина, присутствуют другие исключительно сильные антиоксиданты.

Табл 3. Влияние Биокуратора на скорость восстановления ДФПГ.

Обрaзец Дипептиды, концентрация в образцах (mM) Антиоксидантная
активность
Анзерин Карнозин Сумма Концентрация образца в пробе (mM) Восстановление ДФПГ (нмоль/мин)
Биокуратор 7,65 3,25 10,9 0,22 3,19
Карнозин 20 0,40 0,26
0,8 0,39

2. Ингибирование реакций перекисного окисления протеолипидов сыворотки крови человека

Карнозин в количестве 11,3 мкг на пробу практически не защищает липиды от окисления и не влияет на длительность латентного периода (длительность латентного периода (t) возрастает с увеличением концентрации антиоксидантов, присутствующих в пробе, а так же с увеличением содержания хелатирующих веществ, т.е. веществ, способных связывать свободные радикалы). При почти таком же суммарном содержании дипептидов (рис.1) Биокуратор проявляет более высокую активность. С дальнейшим ростом содержания дипептидов антиоксидантная активность Биокуратора увеличивается. При содержании дипептидов в пробе в количестве 28,5 мкг, Биокуратор показал наивысшую активность по всем показателям, снизив окисляемость липидов практически до нуля и увеличив длительность латентного периода более чем в 2,5 раза. Синтетический карнозин при вдвое большей концентрации (56,5 мкг в пробе) проявил значительно более низкую эффективность по всем показателям.


Рис.1. Влияние синтетического карнозина на показатели перекисного окисления липидов.
* - суммарное содержание карнозина и анзерина на пробу.

В ряде исследований показано, что некоторые природные вещества усиливают биологические эффекты карнозина. Результаты наших исследований объясняются синергизмом действия карнозина, анзерина и низкомолекулярных пептидов – комплекса, полученного из природного источника.

Защита кожи от окислительного стресса, вызванного ультрафиолетовым излучением

Избыточное ультрафиолетовое излучение солнца, интенсивность которого постоянно увеличивается с ростом «озоновых дыр» в атмосфере, вызывает окислительный стресс и преждевременное старение кожи (8, 10). Под влиянием хронического облучения в коже развивается комплекс изменений, который называется «фотостарением»: уменьшается содержание коллагена и гликанов, между молекулами коллагена образуются поперечные «сшивки», развивается эластоз, кожа теряет упругость, становится сухой, приобретает морщины, страдает иммунитет, возрастает частота мутаций генетического аппарата клеток. Это ведет к преждевременному увеличению «биологического возраста» и к существенному повышению риска развития раковых заболеваний.

Рис. 2. Зависимость коэффициента защиты от УФ в зависимости от концентрации БИОКУРАТOРА в креме.

Коэффициент защиты показывает во сколько раз замедляет исследуемое вещество развитие эритемы.

Свободные радикалы, образующиеся после УФ облучения, запускают синтез NO – самого мощного из всех известных сосудорасширяющих веществ. Поэтому уровень повреждающего действия ультрафиалета можно оценивать по уровню ответной эритемной реакции кожи. Повреждение можно оценивать по времени появления эритемы после облучения и по интенсивности эритемы.В эксперименте участвовали 10 волонтеров с I и II типом кожи. Время облучения участков кожи спины стандартным УФ источником составляло 1,5 мин.Результаты исследования показали, что Биокуратор в составе крема эффективно защищает кожу от повреждения, вызванного УФ облучением, что проявляется в увеличении времени проявления эритемы и в уменьшении степени ее выраженности. Защитное действие препарата возрастает с увеличением его концентрации в кремовой основе (рис. 2). Биокуратор в исследованном диапазоне разведений замедляет развитие эритемы, по сравнению с контролем, в среднем в 2,58 раза. Защитные свойства карнозина и Биокуратора оценивали так же путем объективной регистрации интенсивности эритемы с помощью датчика MEXAMETER (СK-electronics, Германия). Как синтетический карнозин, так и Биокуратор снижают интенсивность эритемы.

Рис. 3. Относительный прирост индекса эритемы после облучения кожи защищенной карнозином и Биокуратором. * - концентрация вещества в нейтральной кремовой основе.

Замедленное развитие эритемы и уменьшение степени ее выраженностти на участках кожи, защищенных синтетическим карнозином или Биокуратором, свидетельствует о том, что указанные препараты препятствуют расширению сосудов кожи, вызванному временным параличом их гладкой мускулатуры. Сосуды, как известно, парализуются вследствие избыточного накопления в ткани сосудорасширяющих веществ, среди которых самым мощным является оксид азота (NO). Известно, что провоцирующим фактором синтеза NO являются продукты перекисного окисления. Высокая антиоксидантная активность Биокуратора и карнозина является фактором, уменьшающим количество свободных радикалов образующихся при окислительном стрессе, а, следовательно, и степень повреждения кожи.

Влияние Биокуратора на упругость кожи

Свободные радикалы, образующиеся при окислительном стрессе, способствуют образованию сшивок между молекулами коллагена, нарушению их пространственной организации. Постоянное воздействие на кожу неблагоприятных факторов приводит к старению кожи, нарушению структуры соединительной ткани дермы и уменьшению упругости кожи. Старение кожи во многом связано с уменьшением пролиферативной активности фибробластов, а так же их способности синтезировать коллаген. Известно, что карнозин увеличивает активность фибробластов (7) и синтез соединительно-тканных волокон, а следовательно и упругость кожи. Изменение упругости кожи связано преимущественно с тремя механизмами: во-первых, с влиянием биологически активных веществ на синтез и деградацию соединительнотканных волокон, во-вторых, с изменением активными веществами пластических свойств эпидермиса (11), в-третьих, с изменением водного баланса кожи (9). В исследованиях приняли участие 9 волонтеров (4 мужчины, 5 женщин в возрасте 23-45 лет). Крем с Биокуратором в концентрации 5 % наносили на кожу в области между большим и указательным пальцами правой руки в течение 10 дней. В качестве контроля использовался симметричный участок на левой руке.Для определения упругости использовали датчик (рис. 4), позволяющий определить величину отрицательного давления Р, которое необходимо приложить к ограниченному участку поверхности кожи площадью S, чтобы вызвать ее куполообразное выпячивание в отверстие датчика на высоту h. Величина этого давления тем больше, чем выше упругость кожи. Регистрация и измерение давления осуществляются с помощью програмно-аппаратного комлекса PowerGraph (Д. Измайлов, ООО «Интероптика-С», ФФМ МГУ).

Рис. 4 Измерение упругости кожи «вакуумным методом».
h- величина деформации кожи, р – измеряемое отрицательное давление

Рис. 5. Влияние длительного (в течение 1 недели) наружного применения Биокуратора на упругость кожи.
Увеличение упругости после аппликаций Биокуратора в сравнении с контролем достоверны. N=9, p=0,005

После применения Биокуратора упругость кожи у волонтеров к концу эксперимента, длившегося 1 неделю, возросла в среднем на 40,5% по сравнению с исходным уровнем и на 30% по сравнению с контролем. Большой разброс значений упругости обусловлен, во-первых, конституциональной неоднородностью группы волонтеров, во-вторых, суточными колебаниями содержания жидкости в коже. Не смотря на большой разброс значений разница между контролем и Биокуратором достоверна (Wilcocson Ranc t-sum test: ). Нами были проведены дополнительные исследования влияния однократной аппликации Биокуратора на упругость кожи в сравнении с водой и синтетическим карнозином. Использовались аппликации водных растворов веществ. В исследованиях приняла участие группа из 12 человек. Исследования показали, что предварительное смачивание кожи водой уменьшает ее упругость через 30 мин в среднем на 12% (рис.5). Это обусловлено размягчением самого твердого - рогового слоя кожи и изменением пластических свойств кератина (9, 11). Растворы Биокуратора и карнозина увеличивают упругость кожи на 19% и 30% соответственно.

Рис. 5 Влияние карнозина и Биокуратора на упругость кожи.
По оси ординат – величина упругости кожи в % от исходного уровня.
* - концентрация вещества в растворе

Возрастание упругости кожи после однократных аппликаций Биокуратора было подтверждено с помощью другого – динамического метода определения частоты резонанса кожи. В рамках исследования проведено 15 измерений на одном человеке в различное время дня, для того, что бы исключить влияние на упругость кожи суточных колебаний водного баланса.Результаты исследования показали (рис. 6), что под влиянием однократной аппликации Биокуратора в первые 5 минут наблюдается уменьшение частоты резонанса, что свидетельствует о размягчении кожи. В последующие 30 мин наблюдается постепенное увеличение частоты механического резонанса кожи, что свидетельствует об увеличении ее упругости.

Рис 6. Изменение частоты резонанса и показателя затухания одиночного колеания кожи в течение 20 мин. После аппликации Биокуратора.

По современным представлениям, происходящим от классических работ Старлинга, высокая упругость ткани является основным препятствием для чрезмерной фильтрации жидкости из капилляров в окружающие их межклеточные пространства. Поэтому способность Биокуратора повышать упругость кожи предполагает и его способность препятствовать избыточному накоплению в тканях жидкости, устранять отеки или противодействовать их развитию.Таким образом, полученные результаты подтверждают современные представления о гистидин-содержащих дипептидах - карнозине и анзерине - как о природных биорегуляторах, которые защищают клетки, органы и ткани от повреждений, вызванных воздействием разнообразных неблагоприятных физико-химических факторов: ионизирующих и неионизирующих излучений, недостатка кровоснабжения, недостатка или избытка кислорода, окислительного, холодового и теплового стресса и других. Исключительно высокая антиоксидантная активность Биокуратора в сравнении с карнозином как таковым позволяет предположить наличие в его составе других неидентифицированных высоко активных природных антиоксидантов.

В заключение следует отметить, что Биокуратор, как и карнозин, абсолютно лишен токсичности, он не раздражает кожу. Мы не зафиксировали ни одного случая аллергических реакции или раздражения кожи в ответ на аппликации синтетического карнозина или Биокуратора. Более того, есть веские основания полагать, что карнозин и анзерин, содержащиеся в Биокураторе и обладающие противовоспалительными, иммуномодулирующими и ранозаживляющими свойствами (1), придают эти свойства и Биокуратору, в состав которого они входят. Биокуратор, являясь сильным антиоксидантом и защищая кожу от окислительного стресса, должен препятствовать не только «фотостарению» кожи, вызванному ультрафиолетовым облучением, но и биологическому старению как таковому. Антиоксидантная активность Биокуратора предполагает также возможность его использование для профилактики онкологических заболеваний кожи.

Все перечисленные полезные свойства Биокуратора делают его весьма перспективным для использования в качестве компонента лечебно-оздоровительной и антивозрастной косметики.

Литература:

1. Болдырев А.А. Карнозин. Издательство МГУ, Москва, 1998, 320 с.
2. Линтнер, К. Биологически активные пептиды: новые перспективы использования в местных препаратах. SOFW Journal (русская версия), 1, 2000, 4-7.
3. Штанцль, К. Дипептид карнозин в косметике «против старения». SOFW – Journal (русская версия), 2002, 5, 20-33.
4. Bakarjiev A, Bauer K, Biosyntesis, release and uptake of carnosine in primary cultures. Biochemistry. Moscow, 65, 917-920.
5. Himukai,M. The characteristics of carnosine transport and carnosine induced electrical phenomena by the everted intestine of guinea pig. Jap. J. Physiol., 1985, 35, 945-952
6. Ikeda, D., Wada, S., Yoneda, C., Abe, H. and Watabe, S. Carnosine stimulates vimentin expression in cultured rat fibroblasts. Cell Struct. Funct., 1999, 24, 79-87.
7. Mc-Farland, G.A. and Holiday, R. Retardation of the senescence of cultured human diploid fibroblasts by carnosine. Exp. Cell Research, 2000, 212, 167-175.
8. Miyachi, Y. Photoaging from an oxidative standpoint. J. Dermatol. Sci., 1995. Mar. 9(2): 79-86.
9. Оvergaard Olsen L, Jemec GB. The influence of water, glycerin, paraffin oil and ethanol on skin mechanics. Acta Derm Venereol. 1993 Dec;73(6):404-6.
10. Pugliese, P.T. The skin, free radicals and oxidation stress. Dermatol. Nurs, 1995, Dec., 7(6): 361-9, quiz 370-1
11. Papir YS, Hsu KH, Wildnauer RH., The mechanical properties of stratum corneum. I. The effect of water and ambient temperature on the tensile properties of newborn rat stratum corneum. Biochim Biophys Acta. 1975 Jul 14;399(1):170-80.